产品货号:
SYA004
中文名称:
单增李斯特氏菌单重荧光PCR检测试剂盒
英文名称:
产品规格:
48次/盒
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒适用于增菌培养物、疑似病料及食品中单增李斯特氏菌(Lm)的检测,其检测结果仅供参考。
本试剂盒用一对单增李斯特氏菌特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光PCR技术对单增李斯特氏菌DNA进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染
者的病原学诊断。本试剂盒中单增李斯特氏菌的探针报告基团为FAM。
试剂盒组成:
储存条件:-20℃,有效期6个月。
使用方法:
一、样品采集:
?食品样品:样品的采集与预培养按照《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》(GB 4789.30-2010)要求进行。
?粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。
?病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注:上述样品建议经过增菌后,收集培养物用于检测。
二、DNA提取:
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液,按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的
商业化产品,并按照相应试剂盒说明进行操作。
?液体培养物:取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中,8000rpm离心3min,尽量吸弃上清,加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm
离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
?固体培养物:挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
?粪便样品:挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中,加入0.5mL生理盐水,振荡混匀,13000rpm离心3分钟,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃
恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
?其他液体标本:取标本2-3mL,13000rpm离心3min,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR
反应。
注:建议采用相关标准方法进行前增菌,并按照6.2.1方法进行提取。阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5μL加入到反应体系中即可。
由于阳性对照浓度较高,建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
三、检测步骤:
1.试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(Lm-qPCR MIX),室温融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL,向每管中加入处理后样品/阴
性对照(NTC)/阳性对照(Lm-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
2.qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件:
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM,淬灭基团:NONE,请勿选择ROX参比荧光。
四、结果分析:
1.结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2.试验成立判定
?阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
?阳性对照(Lm-PTC):均产生扩增曲线,且Ct值≤30。
?以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
3.结果判定
?在试验成立的条件下,Ct值≤30的样本为阳性,表明Lm核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明Lm核酸阴性。
?如果30<Ct值≤35,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行Lm qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,则判为样本阳性,表明Lm核酸阳性;否则判为样本阴性。
五、注意事项:
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管应高压灭菌,而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
相关搜索:单增李斯特氏菌单重荧光PCR检测试剂盒
本试剂盒用一对单增李斯特氏菌特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光PCR技术对单增李斯特氏菌DNA进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染
者的病原学诊断。本试剂盒中单增李斯特氏菌的探针报告基团为FAM。
试剂盒组成:
组份 | 数量 | 规格 |
单增李斯特氏菌荧光qPCR反应液(Lm-qPCR MIX) | 1 管 | 720μL/管 |
DNA抽提液(DNA Extraction) | 2管 | 1.5mL/管 |
阴性对照(NTC) | 1管 | 50μL/管 |
阳性对照(Lm-PTC) | 1管 | 50μL/管 |
储存条件:-20℃,有效期6个月。
使用方法:
一、样品采集:
?食品样品:样品的采集与预培养按照《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》(GB 4789.30-2010)要求进行。
?粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。
?病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注:上述样品建议经过增菌后,收集培养物用于检测。
二、DNA提取:
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液,按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的
商业化产品,并按照相应试剂盒说明进行操作。
?液体培养物:取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中,8000rpm离心3min,尽量吸弃上清,加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm
离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
?固体培养物:挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
?粪便样品:挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中,加入0.5mL生理盐水,振荡混匀,13000rpm离心3分钟,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃
恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
?其他液体标本:取标本2-3mL,13000rpm离心3min,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR
反应。
注:建议采用相关标准方法进行前增菌,并按照6.2.1方法进行提取。阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5μL加入到反应体系中即可。
由于阳性对照浓度较高,建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
三、检测步骤:
1.试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(Lm-qPCR MIX),室温融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 |
荧光PCR反应液 | 15μL | N×15μL |
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL,向每管中加入处理后样品/阴
性对照(NTC)/阳性对照(Lm-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
2.qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件:
1循环 | 50℃ for 2 min | |
预变性 | 1循环 | 95℃ for 10 min |
PCR扩增 | 40循环 | 95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec |
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM,淬灭基团:NONE,请勿选择ROX参比荧光。
四、结果分析:
1.结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2.试验成立判定
?阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
?阳性对照(Lm-PTC):均产生扩增曲线,且Ct值≤30。
?以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
3.结果判定
?在试验成立的条件下,Ct值≤30的样本为阳性,表明Lm核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明Lm核酸阴性。
?如果30<Ct值≤35,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行Lm qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,则判为样本阳性,表明Lm核酸阳性;否则判为样本阴性。
五、注意事项:
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管应高压灭菌,而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
相关搜索:单增李斯特氏菌单重荧光PCR检测试剂盒